Визуализация и распространение живых клеток альфа-герпес-вируса.

1. Аннотация
2. Вступление
3. Представительные результаты
4. Антероградный Спред
5. Анализ данных
6. обсуждение
7. Раскрытие информации
8. Подтверждения

Мэтью П. Тейлор1,2, Радомир Кратчмаров2, Линн В. Энквист2

1 Кафедра иммунологии и инфекционных заболеваний, Монтанский государственный университет , 2 Кафедра молекулярной биологии, Принстонский университет

Образец цитирования: Тейлор М.П., ​​Крачмаров Р., Энквист Л.В. Получение живых клеток альфа-герпес-вирусной транспортировки и распространения вируса альфа-герпеса. J. Vis. Exp. (78), e50723, doi: 10.3791 / 50723 (2013).

Аннотация

Достижения в методах флуоресцентной микроскопии живых клеток, а также в создании рекомбинантных вирусных штаммов, которые экспрессируют флуоресцентные слитые белки, позволили в реальном времени визуализировать перенос и распространение инфекции нейронов вирусом альфа-герпеса. Использование новых флуоресцентных слитых белков для вирусных мембран, оболочек и капсидов, в сочетании с визуализацией живых клеток, позволило идентифицировать сборки вирусных частиц, переносимых внутри аксонов. Подобные инструменты были успешно использованы для анализа клеточного распространения вирусных частиц для количественного определения количества и разнообразия вирионов, передаваемых между клетками. Важно отметить, что методы визуализации живых клеток при транспорте и распространении антероград позволяют получать огромное количество информации, включая скорости переноса частиц, распределение частиц и временный анализ локализации белка. Наряду с классическими вирусными генетическими методами, эти методологии предоставили критическое понимание важных механистических вопросов. В этой статье мы подробно описываем методы визуализации, которые были разработаны, чтобы ответить на основные вопросы транспорта и распространения вируса альфа-герпеса.

Вступление

Инфекция периферической нервной системы (PNS) вирусами альфа-герпеса, такими как вирус простого герпеса (HSV) -1, -2 и вирус псевдобешенства (PRV), включает в себя несколько сложных и строго регулируемых этапов на протяжении всего жизненного цикла вируса. Транспорт внутри нейронов PNS является критическим во время событий как первичной вирусной инфекции, так и последующего распространения между хозяевами. Молекулярные механизмы, которые модулируют два компонента жизненного цикла вируса; Направленный транспорт вирусных сборок от клеточных тел в пределах аксонов (антероградный транспорт) и последующая передача вирионов к восприимчивым клеткам (антероградное распространение) важны для понимания патогенеза герпесвируса.

Транспорт и выход вирусных частиц в нейронах зависит от сборки зрелого инфекционного вириона1,2. Ранее фиксированные анализы, включая иммунофлуоресценцию (IF) и электронную микроскопию (EM), использовали для изучения состояния сборки частиц и взаимодействия белков, связанных с транспортом и распространением вирионов 3-6. Однако динамическая природа переноса вирионов и экспериментальных артефактов, введенных путем химической фиксации, противоречила интерпретации фиксированных изображений 7,8. Недавно был описан ряд вирусно-флуоресцентных слитых белков для HSV и PRV, которые оказывают незначительное влияние на функцию белка. Флуорофоры зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (mCherry или mRFP) часто объединяют в пару, чтобы получить возможность визуализации двух из трех структурных компонентов зрелого вириона: капсида, тегума и гликопротеина 9-11. Визуализация живых клеток антероградного транспорта с использованием вирусов с двумя метками визуализирует состояние сборки вирусных частиц во время транспортировки. Подобные экспрессирующие флуорофор вирусные штаммы используются для визуализации числа и разнообразия вирусных геномов после распространения 12,13. Свойства флуоресцентных белков (обзор в 14,15) значительно влияет на способность визуализировать вирусные или клеточные сборки. Собственные свойства флуоресцентного белка, включая самовоздействие и стабильность, следует учитывать при разработке и тестировании новых слитых белков для сохранения функциональности дикого типа.

В сочетании с флуоресцентными белками слияния, две хорошо охарактеризованные системы культивирования клеток in vitro используются для визуализации живых клеток герпесвирусной инфекции: диссоциированные 16 и компартментализированные 17 ( рис. 1А ) нейроны верхних шейных ганглиев крысы (SCG). В обеих системах эмбриональные SCG рассекаются, диссоциируются на отдельные клетки и высеваются для культивирования in vitro 18. Нейроны SCG являются частью вегетативной нервной системы и могут быть легко культивированы и дифференцированы с помощью фактора роста нейронов (NGF) в зрелую поляризованную состояние ex vivo . Диссоциированные нейроны SCG образуют расширенную сеть аксонов, которая позволяет визуализировать вирусные частицы, когда они подвергаются антероградному транспорту. 6. Компартментализированные культуры SCG обеспечивают жидкую изоляцию тела нейронных клеток (S-компартмент) и дистальных концов аксонов (N-компартмент) 19. A Ряд подробных протоколов для конструирования и использования разделенных нейронов с использованием оригинальных 20 или модифицированных камер Кэмпено 17 был опубликован ранее. Флюидная изоляция позволяет проводить селективную инфекцию тел нейронных клеток и обнаруживать вирионы потомства после транспорта к изолированным концам аксонов. Покрытие эпителиальных клеток через концы до заражения обеспечивает клетки-реципиенты для распространения вирусной инфекции.

Существует много важных элементов, важных для всех экспериментов по визуализации живых клеток, но наиболее важными для наших протоколов являются: автоматическое получение изображений, флуоресцентное освещение, скорость формирования изображений и контроль окружающей среды. Для всех экспериментов с изображениями мы используем инвертированный автоматический микроскоп с эпифлуоресцентной подсветкой ( рис. 1В ). Микроскоп построен на базе Nikon Eclipse Ti и использует несколько управляемых компьютером моторизованных систем для быстрой перенастройки микроскопа во время автоматического получения изображений. Для флуоресцентного освещения мы используем ртутную дуговую лампу широкого спектра действия, которая может быть ослаблена с помощью фильтров нейтральной плотности вдоль пути освещения. Фильтры возбуждения ограничивают спектр флуоресцентного освещения и в паре с многопроходными дихроичными зеркалами и фильтрами флуоресцентного излучения визуализируют конкретные флуоресцентные соединения. Фильтры возбуждения и излучения установлены в независимых быстро переключающихся колесах фильтра, чтобы обеспечить быстрое последовательное получение различных флуоресцентных каналов. Скорость получения изображения дополнительно повышается с помощью чувствительной и быстрой камеры EM-CCD, полезной для обнаружения сигналов низкой интенсивности и короткого времени считывания изображения. Контроль за состоянием окружающей среды на микроскопе достигается с помощью инкубатора с подогревом рабочей поверхности и нагревателя объектива для поддержания образцов при повышенных температурах, в то время как увлажненная и обогащенная CO2 атмосфера поступает в инкубатор. Микроскоп хранится в затемненной комнате с температурой окружающей среды, близкой к 25 ° C, а внешний свет сводится к минимуму благодаря затемненным шторам на всех окнах. Следующие протоколы описывают использование этой системы для антероградного транспорта и анализов распространения.

Существует ряд альтернатив для контроля переменных визуализации живых клеток. Контроль настроек микроскопии может выполняться вручную или через автоматизированные системы, зависящие от проприетарного программного обеспечения. Флуоресцентное освещение может быть достигнуто с помощью галогенных, светодиодных или лазерных источников. Скорость формирования изображения зависит от скорости переключения фильтра и времени визуализации сигнала с помощью парной системы обнаружения. Контроль за состоянием окружающей среды может быть достигнут с помощью специального оборудования на стадии микроскопа, размещения всего микроскопа или его части в отапливаемом и увлажненном боксе или путем повышения температуры в помещении, где будет проводиться микроскопия. Каждая из этих альтернатив имеет свои преимущества и недостатки, связанные с затратами и производительностью.

В последующем протоколе мы детализируем использование визуализации живых клеток для изучения быстрого антероградного транспорта и антероградного распространения вирусов альфа-герпеса с использованием рекомбинантных вирусных штаммов. Визуализация живых клеток в реальном времени визуализирует совместную локализацию капсида, тегума и / или гликопротеина на динамических структурах, подвергающихся транспорту в аксонах 11. Ночная съемка с замедленной съемкой компартментализированных нейронных культур визуализирует выход аксонов вириона и инфекцию чувствительных клеток 12. Протоколы, представленные здесь, имеют были оптимизированы для использования с нашей конкретной системой визуализации, но представлены в широком смысле относительно четырех элементов визуализации живых клеток. В обсуждении мы подробно рассмотрим некоторые из оптимизации, которая необходима для успешного эксперимента.

Представительные результаты

Применение этого протокола к инфекциям диссоциированных культур SCG с помощью PRV 348, рекомбинантного штамма PRV, экспрессирующего слитые белки GFP-Us9 и gM-mCherry, облегчает визуализацию антероградного транспорта вирионов ( Рисунок 3 и Дополнительный фильм 4 ). Включение этих слитых белков в вирусные частицы приводит к их обнаружению при транспортировке точек, а вышеупомянутые условия визуализации минимизируют смещение каждого флуорофора на движущейся частице во время переключения фильтра. В трехминутном окне визуализации обычно наблюдаются многочисленные транспортирующие точки, и быстро генерируются большие размеры образцов для анализа колокализации. Ранее мы количественно оценили колокализацию GFP-Us9, белка, нацеленного на аксоны вируса альфа-герпеса, с другими структурными белками, используя этот подход 11. Аналогичные анализы других двойных рекомбинантных штаммов PRV также были описаны 11, а недавняя работа документировала совместный транспорт. белков PRV с флуоресцентно меченным моторным белком-хозяином в дальнейшем расширении этого протокола 21. Использование быстро переключающихся колес фильтра и парных многопроходных дихроичных зеркал обеспечивает быстрое последовательное получение двух или более флуоресцентных каналов. В настоящее время мы можем добиться двухканального последовательного захвата со скоростью до 0,8 кадра в секунду. Для одноканальной видеомикроскопии, которая ограничена только временем экспозиции флуоресценции и временем считывания камеры, мы можем достичь скорости захвата, превышающей 6 кадров в секунду.

Антероградный Спред

Чтобы визуализировать события распространения антероград, интересующие области визуализируют каждые 5-10 минут в течение 20-часового периода, в течение которого вирионы будут транспортироваться вниз и выходить из аксонов, заражая близлежащие эпителиальные клетки. Типичный кадр из большой области изображения представлен на рисунке 4А и в дополнительном фильме 5 . Обратите внимание на пространственно разделенную природу клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок, что свидетельствует о первичной инфекции от аксонов. Зараженные клетки можно отслеживать в обратном направлении во время фильма, чтобы визуализировать флуоресцентные капсиды, которые инициировали вирусную инфекцию. Эти отдельные ячейки могут быть изолированы от большого кадра и отслеживаться без значительной потери деталей. Репрезентативная рамка ( рис. 4В ) из Дополнительного фильма 6 показывает время, после которого вирионы осаждают флуоресцентный капсид в цитоплазму.

Анализ данных

Для наборов данных визуализации живых клеток может быть выполнен ряд различных анализов, включая отслеживание частиц, исследования колокализации и количественную оценку событий распространения вирионов. Мы часто выполняем наши анализы непосредственно в программном обеспечении NIS Elements или с помощью расширения модуля, доступного для пакета программного обеспечения ImageJ, который обеспечивает поддержку типов файлов .nd2. Различные гипотезы и экспериментальные установки требуют уникальных аналитических методов. Наша группа описала методы оценки колокализации флуоресцентных белков на динамических структурах 11,21 и покадровой количественной оценки отдельных событий распространения частиц 10,12,22. Методологии, описанные в этой рукописи, и наши предыдущие исследования являются гибкими и могут применяться к различным вирусным инфекциям, а также к транспорту клеточных структур, например, митохондрий 23.

Рисунок 1. Схема микроскопии для визуализации живых клеток. А) Типы культур, используемые для изучения антероградного транспорта (диссоциированного) и антероградного распространения (камерного) соответственно. Панель 1 представляет собой фазово-контрастное изображение зрелой диссоциированной верхней части шейного ганглия (SCG). Панель 2 представляет собой схематическое изображение разделенной системы культивирования, изображенной на панели 3, с нейронами SCG, покрытыми в левом отсеке, с аксональными выступами, проходящими под внутренними барьерами в крайний правый отсек. Б) Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп и конфигурация верхнего этапа инкубатора, используемые для экспериментов с видео микроскопом.

Рисунок 2. Программный интерфейс NIS-Elements. Снимок экрана стандартного пользовательского интерфейса в NIS-Elements. Кнопки «Воспроизвести» и «Стоп» управляют окном живого изображения, отображающим текущие аппаратные конфигурации для формирования изображения, а также то, что в данный момент отображается. На верхней панели расположены серии оптических конфигураций, в которых реализованы предустановленные аппаратные настройки для настройки микроскопа для транс-подсветки или обнаружения флуоресценции. Настройки управления камерой и экспозиции позволяют настроить обнаружение камеры для оптимизации качества изображения и скорости. Все эксперименты координируются с использованием контроля ND Acquisition.

Рисунок 3. Визуализация живых клеток аксонов SCG через 8 часов после инфицирования PRV 348. Нейроны, инфицированные PRV 348, экспрессируют слитые белки мембран GFP-Us9 и gM-mCherry. Антероградные транспортные структуры в дистальных аксонах визуализируются в двух флуоресцентных каналах, GFP и мчерри. Антероградная транспортная структура (белая стрелка) развивается внутри аксона, как показано на последовательных изображениях, снятых из Дополнительного фильма 4. Два флуоресцентных белка пространственно смещены из-за последовательного получения флуоресцентных каналов и быстрого перемещения вирусных структур.

Рисунок 4. Ночная интервальная съемка антероградных событий распространения от инфицированных аксонов к скоплениям эпителиальных клеток во время многоцветной инфекции. Репрезентативные изображения из одной позиции, большое изображение в виде покадровой видеозаписи передачи вирионов от инфицированных аксонов PRV 427 в эпителиальные клетки реципиента. А) Объединенное изображение передаваемых флуоресцентных изображений YFP и RFP в момент времени после заражения, когда клетки-реципиенты начинают экспрессировать слитые белки YFP-CAAX и VP26-mRFP. На второй панели каналы YFP и RFP показаны вместе. Обратите внимание на большое количество точечных mRFP, связанных с трактами аксонов. Это собранные вирионы, которые переносятся на большие расстояния в аксонах ( Дополнительный фильм 2 ). Белый прямоугольник представляет интересующую область, выделенную в части B. B) Репрезентативное изображение эпителиальных клеток-реципиентов, содержащих инфицированные капсидные сборки (см. Также Дополнительный фильм 3). Панель 1 представляет собой объединение переданного и RFP-каналов. Панель 2 - только канал RFP. Панель 3 представляет собой канал RFP со схематическим представлением контура ячейки (сплошная белая линия), ядра (белая линия со штриховкой) и аксонов (синие линии).

Дополнительный фильм 1. Настройки программного обеспечения для быстрого последовательного получения аксональных вирионов. Представлены этапы, связанные с определением настроек экспозиции, настройкой контроля захвата ND и получением фильма быстрого захвата кадра флуоресцентных вирионов, переносящих аксональный транспорт. Нейронную культуру SCG инфицировали PRV 427 за восемь часов до визуализации. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

Дополнительный фильм 2. Настройки программного обеспечения для ночной визуализации распространения от аксона к клетке. Представлены этапы, связанные с настройкой элементов управления получением ND для ночной визуализации событий распространения от аксона к клетке. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

Дополнительный фильм 3. Преобразование файлов .nd2 в презентабельные форматы фильмов. Шаги, связанные с преобразованием файлов .nd2 исходных данных в форматы файлов .avi или .mov для представления с использованием обычных видеопроигрывателей. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

Дополнительный фильм 4. Визуализация живых клеток аксонов SCG через 8 часов после заражения PRV 348. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

Дополнительный фильм 5. Большая область изображения ночной съемки распространения от аксона к клетке. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

Дополнительный фильм 6. Увеличенная область ночной интервальной съемки распространения от аксона к клетке. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм ,

ШтаммGenotypeUtility

PRV 341 GFP-Us9 (мембрана) / mRFP-Vp26 (капсид) Эксперименты по транспортировке вирионов11 PRV 348 GFP-Us9 (мембрана) / gM-mCherry (мембрана) Эксперименты по транспортировке вирионов11 PRV 427 mRFP-VP26 (капсид) / YFP- CAAX (клеточная плазматическая мембрана) Эксперименты по антероградному распространению10

Таблица 1. Полезные рекомбинантные штаммы PRV, экспрессирующие флуоресцентные слитые белки.

35 мм культуральное блюдо со стеклянным дном MatTek Corporation; Ashland, MA P35G-1.5-20-C 35 мм μ-Dish Ibidi USA LLC, Верона, WI 81156 Корпус микроскопа Nikon Instruments Inc. Nikon Eclipse Ti Моторизованный микроскоп XY stage Prior Scientific; Rockland, MA H117 Колеса фильтра ProScan с плоским верхом и моторизованным колесом фильтра Prior Scientific HF110 Колесо фильтра на 10 положений Источник люминесцентного освещения Lumen Dynamics; Миссиссауга, Онтарио, Канада X-Cite 120Q Многополосные флуоресцентные фильтры Chroma Technology Corp .; Bellows Falls, VT 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET EM-CCD камера Andor Technology США; Саут-Виндзор, Коннектикут iXon3 897 Экологический инкубатор Chamlide с высокой степенью защиты окружающей среды; Сеул, Южная Корея TC-L-10 Обогрев объектива Bioptecs; Butler, PA 150803 Controller 150819-12-08 Программное обеспечение для анализа нагревателей Nikon Instruments Inc .; Мелвилл, Нью-Йорк NIS Elements

обсуждение

Целью визуализации живых клеток является наблюдение биологических процессов в том виде, в котором они происходят без существенных изменений в результате наблюдения. Эта цель достигается путем оптимизации трех переменных: контроля окружающей среды, скорости визуализации и флуоресцентного освещения. Эти взаимозависимые переменные должны быть сбалансированы для достижения жизнеспособных условий визуализации. Представленные протоколы используют конкретные условия для получения репрезентативных результатов. Мы кратко обсудим экологический контроль и наблюдательный ущерб, прежде чем детализировать конкретные представленные методы.

Установление и поддержание соответствующих биологических условий на микроскопе имеет решающее значение для успешного мониторинга клеточных событий. Достижение целевых условий зависит от ряда переменных, характерных для микроскопа и конфигурации инкубатора. Все настройки инкубатора должны быть проверены с использованием независимого измерения температуры ложного образца в инкубаторе, взятого в нескольких положениях, включая; точка объективного контакта, середина культурального блюда и край культурального блюда. Настройки должны быть оптимизированы, чтобы минимизировать области, которые на 1 ° C теплее 37 ° C, а также поддерживать температуру около 37 ° C в точке соприкосновения с объективом. Каждое культуральное блюдо и объективная конфигурация, используемая для визуализации, должны быть проверены и проверены перед экспериментом. В идеале все образцы должны подвергаться мониторингу температуры во время визуализации, но это оказывается непрактичным для ряда систем и усложняется, когда используются биологически опасные агенты. Проверка условий инкубации важна, так как инкубационные образцы при слишком низкой или слишком высокой температуре могут привести к артефактным результатам или быстрой деградации клеток.

Выявление и минимизация результатов, возникающих в результате наблюдательного ущерба, важны для разработки протокола. Частое освещение может изменить биологические процессы, необратимо инактивировать флуоресцентные молекулы или вызвать ряд путей гибели клеток. Проверка достоверности температуры важна для воспроизведения биологически сходных условий на вершине сцены, аналогичных условиям в стандартном инкубаторе для тканевых культур. Контроль за эффектами частого освещения более сложен и часто требует повторяющихся методов проб и ошибок. Сравнение параллельных образцов, хранящихся в инкубаторах для тканевых культур на предмет морфологических различий или биологически значимых изменений, может определить, приводит ли условия визуализации живых клеток к значительной клеточной токсичности. В экспериментах, описанных здесь, мы контролировали продуктивность вирусной инфекции через вирусный титр, а также степень распространения вируса между клетками.

Достижение в реальном времени изображения быстрого переноса в аксонах требует оптимизации скорости получения изображения наряду с интенсивностью флуоресцентного освещения. Скорость получения изображения определяется настройками камеры и оборудованием микроскопа, особенно при последовательном сборе нескольких флуоресцентных каналов. Интенсивность освещения влияет на качество флуоресцентных сигналов и скорость получения. Большая интенсивность освещения позволяет легче визуализировать флуоресцентные белки, особенно для тех, которые включаются в частицы в небольших количествах. Тем не менее, образец будет отбеливать быстрее и страдать от усиления фототоксического повреждения. Уменьшение освещенности с помощью фильтров нейтральной плотности требует более продолжительного времени экспозиции, снижения частоты получения изображений и, возможно, вызывает пространственную деформацию флуоресцентных структур из-за их движения во время обнаружения. Нахождение правильного баланса интенсивности освещения с частотой захвата изображения в значительной степени зависит от сигнала флуоресцентного белка и скорости подвижности исследуемой структуры. Необходимо только получить достаточное количество сигнала, чтобы различать флуоресцентные структуры над фоном, а не создавать высококонтрастные изображения, которые требуют более длительного времени экспозиции.

Ночная съемка с замедленной съемкой использует аппаратную конфигурацию, аналогичную аппаратной визуализации в реальном времени, но на нее существенно влияет накопленное фото-повреждение, связанное с длительным, частым флуоресцентным освещением. В отличие от изображений в реальном времени, необходимость ограничить интенсивность флуоресцентного освещения имеет первостепенное значение, и все другие переменные изменяются для учета этого ограничения. Ограничение интенсивности облучения позволяет более часто освещать несколько флуоресцентных каналов без значительного повреждения отображаемых клеток. События антероградного распространения от аксона к клетке различаются по времени и пространству, поэтому визуализация большой области необходима для захвата как можно большего числа этих редких событий.

В ряде публикаций представлены подробные обзоры и рекомендации по методам визуализации живых клеток24-26. Протоколы, подробно описанные здесь, представляют наши лучшие попытки минимизировать влияние флуоресцентной визуализации на репликацию, транспорт и распространение вируса, сохраняя при этом основные признаки вирусной инфекции. Сочетание этих протоколов с тщательной разработкой флуоресцентных слитых белков и надежных нейронных культур ответило на мои фундаментальные вопросы герпесвирусной инфекции и патогенеза.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Подтверждения

LWE и RK поддерживаются грантами Национального института здравоохранения США R37 NS033506-16 и R01 NS060699-03. MPT был поддержан Исследовательской стипендией Американского онкологического общества (PF-10-057-01-MPC). Советы и знания доктора Мэтью Лаймана и доктора Орен Коблер сыграли важную роль в разработке конфигурации микроскопа и методов визуализации живых клеток. Мы также выражаем благодарность Нилу Барлоу и Брайану Т. Каину из Nikon Instruments за их техническую помощь в приобретении, установке и эксплуатации микроскопа.

Похожие

Комментарии